擅长研究白癜风的专家 https://m-mip.39.net/fk/mipso_5951583.html作者：董柳关明
液体活检，即对各种体液中生物分子的检测分析，可用于分析肿瘤来源的DNA、RNA、微小RNA（microRNA，miRNA）和蛋白质等物质［1,2］。血液中的循环游离DNA（cell-freeDNA，cfDNA）长度多为80~bp，主要由凋亡的造血细胞产生［3,4］。健康人血液中cfDNA浓度通常很低［5］。坏死或凋亡的肿瘤细胞能够释放大量cfDNA，故肿瘤患者的cfDNA水平通常较高［6］。这种肿瘤来源的cfDNA被称为循环肿瘤DNA（circulatingtumorDNA，ctDNA），它们携带肿瘤的分子信息，具有作为生物标记物的潜在临床价值。
中枢神经系统（centralnervoussystem，CNS）肿瘤受血脑屏障影响，患者血浆中ctDNA水平往往非常低［7］，此时脑脊液具有独特优势。脑脊液主要形成于脑室脉络丛，在中枢神经系统中不断循环，能直接或间接与脑肿瘤组织接触，有望携带循环肿瘤细胞和ctDNA［8］。正常情况下，脑脊液中细胞很少（0~5个细胞/μl），细胞稀缺性可降低突变检测时正常DNA的背景干扰［9］。此外，脑脊液中固有的核酸酶活性比全血、血浆样本更低，游离核酸稳定性更好，能反映患者长期肿瘤负荷，同时也可随着肿瘤进展呈现出波动［10,11］。在CNS限制性疾病的患者中，脑脊液ctDNA的突变等位基因频率显着高于血浆，体细胞突变的检测敏感性也更高，凸显出脑脊液ctDNA在CNS肿瘤中得天独厚的价值［11］。
尽管组织活检仍是癌症诊疗的金标准，但作为一种价格昂贵的侵入性检查，它并不适用于每个肿瘤患者，肿瘤的位置、大小等都会限制组织活检的使用。尤其是对CNS肿瘤，开颅活检技术复杂，而组织取样具有随机性和局限性，无法检测肿瘤的动态变化［12］，因而亟需更加实用的替代方法，脑脊液液体活检技术极具潜力。
一、ctDNA在CNS肿瘤的应用
世界卫生组织的CNS肿瘤分类（版），首次采用组织学和分子特征结合的分类方式，新增包括：异柠檬酸脱氢酶（isocitratedehydrogenase，IDH）突变型成胶质细胞瘤、H3（组蛋白histone变体H3）K27M突变型弥漫性中线神经胶质瘤、RELA融合基因阳性室管膜瘤、WNT激活型髓母细胞瘤等［13］。年美国国立综合癌症网络（NationalComprehensiveCancerNetwork，NCCN）发布的CNS肿瘤临床实践指南也指出，原发性中枢神经系统淋巴瘤（primarycentralnervoussystemlymphoma，PCNSL）的脑脊液分析不应仅仅包含细胞学检测、流式细胞分析，还应分析其基因重排的情况；对于软脑膜转移癌，评估循环肿瘤细胞能够增加脑脊液肿瘤检测的敏感性。液体活检在CNS肿瘤诊断与治疗中的价值正在逐步得到广泛认可，ctDNA在CNS肿瘤的应用可主要分为如下几个方面。1.诊断肿瘤分型：脑脊液ctDNA突变与肿瘤组织具有较高一致性，能体现肿瘤的基因型，携带CNS病变的突变信息，且随肿瘤的发展呈现动态变化，可用于肿瘤的病理分型［11，14］。胶质瘤是最常见的脑肿瘤，原发性和继发性胶质母细胞瘤在组织学很难区别，但其遗传学特征不同。表皮生长因子受体（epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR）扩增、磷酸酶及张力蛋白同源物（phosphataseandtensinhomolog，PTEN）突变和10号染色体丢失是原发性胶质母细胞瘤的典型特征，继发性胶质母细胞瘤中更常见肿瘤蛋白p53（tumorproteinp53，TP53）突变和19q缺失，IDH1突变更被认为是继发性胶质母细胞瘤的决定性遗传标志［15,16］。数字PCR和靶向测序技术可用于检测脑脊液ctDNA中IDH1、IDH2、TP53等基因，将近80%恶性神经胶质瘤准确分类［17,18］。年，WHO首次在弥漫性中线神经胶质瘤中增加H3K27M突变型这一分类，所有具有这一致病性突变的神经胶质瘤，均应被视为Ⅳ级。Panditharatna等［19］在88%神经胶质瘤患者的脑脊液和血浆中检测出H3K27M，并指出脑脊液中ctDNA含量更高，有利于突变检出。MYD88固有免疫信号转导因子LP突变是PCNSL的常见突变，数字PCR对脑脊液MYD88突变的分析高度可靠，具有诊断价值［20］。脑脊液标本的临床检测敏感性高于血浆，甚至在脑脊液细胞学、细胞流式阴性的情况下，仍能检测到MYD88LP突变［21］，脑脊液ctDNA中MYD88LP突变检测或可作为PCNSL的诊断方式之一。2.指导肿瘤精准治疗、预测突变：脑脊液ctDNA可反映肿瘤的基因信息，从而指导临床用药。此外，脑脊液ctDNA还可发现单次活检或手术标本中遗漏的突变位点，有望为治疗提供新的靶标。O-6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（O-6-methylguanine-DNAmethyltransferase，MGMT）可修复替莫唑胺（temozolomide，TMZ）导致的DNA损伤，因而MGMT高表达与TMZ耐药性密切相关［22］。二代测序（nextgenerationsequencing，NGS）、超敏数字PCR（Methyl-BEAMing技术）可用于检测MGMT甲基化状态［23,24］。此外，Zhao等［14］对神经胶质瘤进行靶向测序，发现有34.04%的突变位点仅在脑脊液ctDNA检测到，而在组织中漏检，其中就包括B-Raf原癌基因（B-Rafproto-oncogene，BRAF）、NRAS原癌基因（NRASproto-oncogene，NRAS）基因突变。BRAF、NRAS基因是EGFR下游信号通路的关键蛋白，其基因改变会显著影响抗EGFR治疗药物的疗效［25］。由于目前治疗原发性CNS恶性肿瘤的靶向药物数量有限，关于使用脑脊液ctDNA指导靶向药物的研究很少。但通过分析脑脊液ctDNA，可了解肿瘤的突变模式，规避无效疗法，或使用特异性疗法（如靶向/免疫学方法）来改进现有治疗方案［26］。实体癌，如黑色素瘤、肺癌和乳腺癌等，常易发生脑或软脑膜转移。脑转移肿瘤是成人最常见的颅内肿瘤，其发病率约为原发性脑肿瘤的10倍，脑脊液细胞学是诊断金标准，患者的靶向疗法一般都基于其原发肿瘤［27］。年NCCNCNS肿瘤临床实践指南明确，对于具有ALK受体酪氨酸激酶（ALKreceptortyrosinekinase，ALK）基因重排、EGFR基因突变的肺癌脑转移患者应采用靶向疗法；对于人表皮生长因子受体2（humanepidermalgrowthfactorreceptor2，HER2）阳性的乳腺癌脑转移患者可采用卡培他滨（capecitabine）结合酪氨酸激酶抑制剂（tyrosinekinaseinhibitors，TKI）的治疗方案。多项研究已证实，脑脊液ctDNA检测优于传统脑脊液细胞学分析，在脑脊液细胞学检查阴性的黑色素瘤、肺癌脑转移患者中，可检测出ctDNA存在BRAF等突变［28,29］。Siravegna等［30］对HER2阳性乳腺癌脑转移患者的标本进行了数字PCR检测及全外显子组测序，发现患者脑脊液ctDNA和血浆ctDNA分别反映了中枢神经和全身性颅外的肿瘤负荷。脑脊液ctDNA中erb-b2受体酪氨酸激酶2基因扩增、MYC基因扩增以及乳腺癌驱动基因突变更加丰富，可指导曲妥珠单抗治疗。脑脊液ctDNA中肿瘤驱动基因的检出率（%）明显高于配对的脑脊液沉淀物（84.6%）和血浆（73.1%）。此外，脑脊液ctDNA中TP53杂合性丢失（lossofheterozygosity，LOH）及EGFR突变的检出率均高于血浆标本［29］。针对血浆中漏检，而在配对脑脊液中检测出的EGFR突变，Huang等［31］综合患者的脑脊液与血浆检测结果，对12例具有EGFR敏感突变的患者采取第一代EGFRTKI治疗，而对具有EGFRTM耐药突变的患者则转用第三代TKI奥西替尼（osimertinib）治疗。同时，脑脊液ctDNA可作为一种微创方式，监测治疗过程中可能产生的耐药性突变。Pentsova等［32］对53例患有实体瘤脑转移或原发性脑肿瘤患者的脑脊液ctDNA进行测序，分析个癌症相关基因，发现在针对致癌激酶的抑制剂治疗期间，部分患者在激酶靶标或激酶旁路途径中发生突变，或出现TMZ相关突变，证实脑脊液ctDNA可作为生物标记物，指导制定靶向治疗方案的可行性。3.评估治疗效果：CNS肿瘤的治疗监测，对于后续治疗方案的选择至关重要。目前常通过患者的临床表现、放射成像和肿瘤标志物进行治疗监测，但治疗过程中肿瘤的假性进展、假性退化和放射性坏死等变化都会干扰影像学诊断［33］。脑脊液ctDNA能随脑肿瘤负荷的改变发生变化。Miller等［34］证实，在脑胶质瘤患者中，脑脊液的基因改变频率和类型与肿瘤活检非常相似，在肿瘤发生的早期阶段，1p/19q缺失、IDH1或IDH2突变可同时出现在配对的脑脊液和组织样本中，而生长因子受体信号通路则随肿瘤发展呈现较大动态变化。液体活检的特异度与敏感度比传统方法更高，取样创伤小并能多次取样，有成为动态监测肿瘤进展与治疗反应的生物标志物的潜力［11］。年一项最新研究发现，CNS淋巴瘤中MRI测量获知的肿瘤负荷与患者脑脊液ctDNA水平一致；而在连续采集的血浆样本中，ctDNA水平则始终保持较低水平，这突显了脑脊液ctDNA在监测CNS淋巴瘤活动性方面的优势［35］。MGMT启动子超甲基化是神经胶质瘤患者无进展生存期的独立预后指标，也可作为肿瘤对烷化剂敏感性的预测指标，用于预测治疗反应［36］。vonBaumgarten等［37］检测了27例原发性和继发性CNS恶性肿瘤（包括PCNSL、胶质瘤；乳腺癌、肺癌脑转移）患者的脑脊液样本，在75%患者中检测到基因组改变，其中40%具有潜在临床作用，包括EGFR、BRAF等基因，这些突变位点可作为临床药物的靶向，研究者据此改善患者的治疗方案，并获得了一定成效。4.检测微小残留病变，预防复发：微小残留病变（minimalresidualdisease，MRD）是液体活检在脑脊液中另一个具有广阔前景的应用领域。利用影像学方法监测肿瘤复发对MRD并不敏感，术后进行液体活检频繁监测，可早期发现微小转移灶。Bobillo等［35］证实在中枢神经系统淋巴瘤中，脑脊液ctDNA水平的升高要早于流式细胞检测，并在病情完全缓解后转为阴性。同时，研究人员采集患者治疗2和4个月后的脑脊液样本，连续检出ctDNA阳性，8个月后确认肿瘤复发，而此前该患者MRI和脑脊液流式检测结果一直呈阴性。值得注意的是，患者脑脊液中ctDNA的变异等位基因频率在肿瘤复发3个月前已经为7%，此时患者无临床症状，脑脊液流式检测正常。该病例提示，脑脊液ctDNA可有助于鉴定复发的微小残留病变，并有望比标准方法更早地检测到疾病复发。PTEN和TP53基因突变常出现在复发性神经胶质瘤患者的脑脊液ctDNA中［14］。还有研究发现，肿瘤组织中MYCN原癌基因扩增与肿瘤进展密切相关，MYCN扩增的肿瘤患者更易出现CNS复发［38］。治疗后脑脊液ctDNA中MYCN拷贝数升高可以作为肿瘤复发的预后标志物［39］。尽管目前对于ctDNA在CNS肿瘤手术切除后，监测MRD作用的研究仍然较少，但ctDNA与CNS肿瘤患者疾病监测中的临床相关性已经明确。二、ctDNA检测方法
总cfDNA中ctDNA通常占比很小（1.0%），且靶向分子改变的等位基因频率（allelefrequency，AF）很低，对技术的敏感度提出了很大挑战。目前的常用检测技术可大致分为靶向和非靶向方法两大类。靶向方法可用于检测特定的、已知分子变化的靶向ctDNA，常使用基于PCR的技术、或采用靶向基因测序，这些测定方法价格相对便宜、周转时间短、易于临床解读；非靶向方法则无需对原发肿瘤中存在的任何特定遗传/表观遗传学变化有先验知识，一般采用全基因组或全外显子组测序，该类方法能够发现新型疾病标志物，但往往需要大量样本、费用高昂［17］。1.扩增受阻突变体系（amplificationrefractorymutationsystem，ARMS）技术：ARMS检测敏感度高，可检测肿瘤细胞中含量为1%的突变，甚至更低频率的突变基因，适合检测已知的单个靶向突变［40］。作为被中国食品药品监督管理局批准的方法，ARMS可成熟应用于检测实体瘤血液标本中的突变，使用相对普及。国家卫生健康委员会发表的《肿瘤个体化治疗检测技术指南（试行）》中建议，对于常见基因突变检测项目，如EGFR基因突变、KRAS基因突变、BRAF基因突变等可采用敏感度高的ARMS方法，但该指南中cfDNA的来源仅为血液标本，未包含脑脊液标本。目前对ARMS在脑脊液检测的研究较少，特别是在原发性CNS肿瘤中，仅有的研究也着眼于脑转移肿瘤。如Yang等［41］探究了ARMS检测肺腺癌脑转移患者脑脊液中EGFR突变的敏感度。ARMS在脑脊液和原发性肿瘤标本之间检测到EGFR突变的敏感度67%（95%CI0.36~0.97）以及特异度82%（95%CI0.59~1.00），证实了ARMS在脑脊液样本中具有较高灵敏，可用于突变检出。2.NGS技术：二代测序方法可用于检测已知的多个靶点或发现未知基因位点［40］。全基因组测序与全外显子组测序可海量获取基因信息，以发现未知的潜在靶向基因，但由于其价格昂贵，不适合作为临床检测项目。基于NGS的靶向测序技术可对靶向区域进行测序分析，大大降低高通量测序的成本，由此也演化出包含不同热点基因的测序panel。检测者可根据自身需要，选择不同panel。如MSK-IMPACT分析，作为美国FDA认证的方法，可检测个与癌症相关基因的所有编码外显子以及来自17个重排基因的46个内含子。利用该方法，研究者在85例神经胶质瘤患者的脑脊液中，检测出42例患者存在ctDNA，与疾病负担和不良后果相关［34］。在肺癌脑转患者的脑脊液中，研究人员则采用了针对肺癌肿瘤中常改变的19个靶基因进行测序，检测出EGFRTM、ALKFC、ALKLM等突变，对患者的药物治疗方案选择具有重要意义［42］。此外还有针对多种脑转移肿瘤的组合测序SV-OCP-ctDNApanel，可成功检测脑脊液中肺癌、胃癌、乳腺癌等原发性肿瘤中种肿瘤相关基因［43］。国内鹍远基因PlasAimTM试剂盒，可检测脑脊液中EGFR、TP53、ALK等12个基因的变异情况，辅助肿瘤脑膜转移的诊疗［44］。3.数字PCR技术：数字PCR技术灵敏度高，能检测出ctDNA中低水平的癌症遗传特征（0.1%的基因突变），受到了广泛
