北京较好的皮肤病医院 http://news.39.net/bjzkhbzy/180906/6508755.html 原文出处： ZhouW,YaoY,ScottA,Wilder-RomansK,DresserJ,WernerC,SunH,PrattD,SajjakulnukitP,ZhaoSetal:PurinemetabolismregulatesDNArepairandtherapyresistanceinglioblastoma.NatCommun.,Jul30;11(1): 研究背景： 胶质母细胞瘤（GBM）是最常见的侵袭性成人原发性脑肿瘤，既往被证明与基因组异质性有关。来自癌症基因组图谱（TCGA）的研究已经定义了GBM中分子驱动改变的多样性。但针对这些异常的靶向治疗在患者中并未取得良好效果。这些令人失望的结果可能与GBM内的基因组异质性相关。事实上，单细胞和区域测序已经发现，驱动分子事件在单个GBM内不同区域和细胞之间是不同的。这种异质性可能解释了为什么提高GBM生存率的治疗策略不需要精确的分子活性改变，如放疗（RT）、替莫唑胺、手术和电场治疗。 RT是GBM患者的关键治疗方式，RT抵抗是GBM复发和死亡的主要原因。只有不超过10%的GBM患者能够存活5年，约80%的患者会在高剂量RT区域内复发。因此，努力克服RT抵抗可能会改善GBM患者的预后。由于GBM的基因组异质性以及靶向治疗的较差疗效，作者试图寻求新的治疗策略，以克服独立于基因型的RT抵抗。 代谢改变是包括GBM在内的多种癌症的标志，受细胞内外因素的调节，并可能独立于基因型调节治疗耐药。重要的是，不同的致癌基因改变可以激活共同的代谢途径，如糖酵解。因此，具有严重肿瘤内基因组异质性的GBMs可能具有相对常见的代谢表型，从而介导RT抵抗。 本研究中，作者发现嘌呤代谢产物可以通过促进RT诱导的DNA双链断裂（DSB）的修复而引起GBM的RT抵抗。FDA批准消耗嘌呤的药物可在体内和体外对多种GBM模型进行RT增敏，包括原代患者来源的异种移植模型（PDX）。肌苷单磷酸脱氢酶1（IMPDH1）的高表达与GBM的低存活率有关，IMPDH1是GTP合成的限速酶。这些研究提示，抑制嘌呤合成可能是一种克服这种基因组异质性疾病治疗抵抗的策略。 研究结果： 结果一：嘌呤与GBM的RT抵抗有关 为了确定GBM的RT抵抗特点，作者对23种永生化的GBM细胞系进行了克隆生存实验，发现不同细胞系RT敏感性分布广泛（图1）。上述细胞系均无异柠檬酸脱氢酶1或2（IDH1/2）突变，因此均为原发性GBM模型，其内在RT抵抗特征与增殖率（补充图1A）或细胞周期分布（补充图1B）无关。应用免疫印迹、流式细胞术或免疫荧光均可检测RT引起的DSB和H2AX的快速磷酸化。作者应用流式细胞术检测发现，RT抵抗细胞株（U87MG和A）和敏感细胞株（KS-1和UMG）在RT后30min和2h均有较高水平的γ-H2AX水平（图1b）。然而，在RT抵抗株中，γ-H2AX在RT后24h恢复到基线水平，而在RT敏感株中仍持续升高。因此，GBM的RT抵抗与DSB的有效修复能力有关。 作者推测，GBM代谢异常可能导致RT抵抗。利用从CCLE获得的转录学数据，提出代谢酶的表达是否可以预测GBM的RT抵抗？与之前的研究一致，IDH1表达增加与GBM的RT抵抗相关（补充图1C），可能是因为该酶是GBM中NADPH的重要来源，谷氨酰胺合成酶（GLUL）的表达也与RT抵抗相关（补充图1D），IDH3a是通过三羧酸循环氧化生成ATP的关键介质，与RT敏感性密切相关（补充图1E）。基因集富集分析显示，与RT敏感性最相关的10个基因集中有3个与ATP氧化生成有关（补充图1F）。然而在前10个与RT抵抗相关的基因中没有发现这样的代谢基因集（补充图1G）。这种相对缺乏可操作的代谢目标表明，需要测量代谢本身，而不是代谢相关转录物的水平。 因此，作者对23个GBM细胞系在未受干扰的指数增长过程中进行了靶向代谢组学分析。将代谢产物分为相应的通路，并确定通路水平变化与RT抵抗之间的相关性，以确定与RT抵抗相关的代谢表型。参与从头合成嘌呤的代谢产物（肌苷酸和鸟苷酸）的下调与RT敏感呈正相关（p0.03，图1c，补充图1H）。胞苷途径的下调是第三大与RT敏感相关的代谢途径，但无统计学意义（p=0.08）。因此，核苷酸总量较低的GBMs，尤其是嘌呤，更可能对RT敏感。 然后，作者进一步探究RT后细胞嘌呤代谢改变情况，RT后2h，DNA损伤发生（图1b），但是细胞尚未发生周期阻滞或死亡（补充图1B），在RT抵抗细胞系中，嘌呤和嘧啶代谢产物均增加（图1d）。然而，对RT敏感的细胞系RT后，嘌呤和嘧啶都没有增加（图1d）。鸟苷酸缺失再次成为与RT敏感性最相关的代谢特征（p=0.，图1e）。与谷胱甘肽相关的代谢产物水平降低与RT敏感性显著相关（p=0.02），这与众所周知的RT杀死细胞的氧化机制一致。腺苷酸（另一种主要嘌呤）的缺失也与RT敏感性显著相关（p=0.，图1e）；这些结果表明，高水平的碱基代谢产物，特别是嘌呤，与GBM耐药有关。 图1 补充图1 结果二：核苷酸补充可以保护GBM免受RT损伤 接下来，作者试图确定在GBM中高碱基代谢物和RT抵抗之间是否存在因果关系。对RT敏感的核苷酸含量少的GBM细胞系添加细胞透性核苷酸（胞苷、鸟苷、尿苷、鸟苷和胸腺嘧啶浓度为80-μM），通过克隆试验测定RT敏感性（图2a）。RT敏感的GBM细胞株（UMG，DBTRG-05MG，和GB-1）受到外源性核苷酸的保护（图1a），增强率（ERs）在0.6-0.8之间（图2b-d）。RT的ER定义为对照组Dmid除以处理组Dmid。ERs值低于1表示辐射防护，高于1表示辐射敏化。核苷酸对RT的保护作用与RT诱导的DSB减少有关。事实上，在所有三种敏感的细胞系中，单独RT组在RT后30min导致γ-H2AX的峰值，但在24h后没有回到基线，而外源性核苷酸处理组在RT后0.5、2、6和24hγ-H2AX水平逐渐降低（图2e-g；补充图2A-C）。 DNA修复开始于损伤后的几秒钟内，因此不确定γ-H2AX水平的降低是否意味着核苷酸阻止DNA损伤的产生或促进其快速修复。因此，作者进行了碱性彗星试验，以测量DNA双链和单链断裂。当在冰上进行以阻止DNA修复时，该试验仅测量DNA损伤的产生。RT后在更高的温度和更长的时间后进行，该试验反映了DNA损伤的产生和修复。当细胞在冰上照射并立即采集时，核苷酸不会改变DNA损伤的数量（图2h，i；补充图2D，E）。然而，在两株对RT敏感的GBM细胞株中（DBTRG-05MG，GB-1），在37℃条件下修复0.5h和4h，外源性核苷酸降低了修复后的DNA损伤（图2h，i；补充图2D，E）。因此，在RT敏感的GBM细胞中补充核苷酸有助于RT诱导的DNA损伤的修复。 图2 补充图2 结果三：抑制GTP合成可使RT抵抗的GBM增敏 基于以上数据，接下来试图探究降低核苷酸含量是否会对GBM的RT抵抗模型产生辐射敏化作用。虽然核苷酸可以被补救合成或从头合成，但大多数GBM被认为依赖于核苷酸的从头合成，而不是核苷酸补救合成。与这一假设相一致的是，在RT抵抗的U87GBM细胞系中，用15N-酰胺谷氨酰胺孵育4h，近一半的GMP、UMP和CMP池被标记，表明了核苷酸从头合成的大量活性。AMP的标记量较少（~30%），可能是因为本底腺苷酸含量更多（补充图3A-D）。这些结果表明，抑制核苷酸的从头合成可能对GBM有治疗作用。 因为鸟苷酸盐是与RT抵抗最相关的代谢通路（图1c，e），作者选择干预该通路（图3a）。霉酚酸（MPA）及霉酚酸酯（MMF）通过阻断IMPDH抑制GTP的合成。这种干预抑制了GTP的从头合成，也部分抑制了GTP补救合成（如果补救合成的碱基是次黄嘌呤，图3a）。MPA和MMF已获FDA批准用于治疗免疫介导的疾病，目前正作为抗癌疗法进行研究，并在中枢神经系统有良好的有效率，用于患有神经结节病等疾病的患者。使用临床相关浓度的MPA（10M）治疗，GTP水平降低了10倍以上，肌苷单磷酸水平增加了10倍以上，ATP水平增加了1.2倍（图3a-d）。 MPA以浓度依赖的方式对两株RT抵抗细胞系进行RT增敏（治疗时间表见补充图3E）（图3e，f）。U87和A在1μMMPA下的ERs值分别为1.2±0.1和1.7±0.3，10μMMPA下的ERs值分别为2.3±0.3，高于GBM标准的放射增敏剂替莫唑胺的辐射增敏效果。当细胞与外源性核苷酸共处理时，MPA的辐射增敏效应消失（U87MG的ER为1.0±0.03，A的ER为1.2±0.1，图3e，f），表明MPA是通过核苷酸消耗而不是脱靶效应发挥辐射增敏效应的。与RT敏感的GBM细胞株不同，外源性核苷酸不能进一步保护RT抵抗的GBM细胞株免受RT伤害（图3e，f）。作者推测，RT抵抗细胞系已经富含核苷酸（图1c，d），这限制了进一步补充核苷酸保护细胞免受RT的能力。 上述结果是对RT抵抗的GBM细胞系分析中获得的。虽然代谢组学和克隆性生存分析易于处理，但这些永生化GBM模型不能完全概括患者GBM的组织病理学或分子特征。因此，作者在原发患者来源的GBM细胞系（即HF和MSP12）中进一步证实。这些原代GBM细胞在无血清条件下生长时形成神经球，天生对RT有抗性，被认为是介导GBM治疗后复发的细胞亚型。由于神经球不适应克隆生存试验，取而代之进行了长期生存试验，以评估RT的效果。原发神经球的处理如补充图3E所示。MPA治疗提高了HF（ER：1.4±0.1）和MSP12（ER：1.7±0.4）的RT敏感性。MPA诱导的放射敏化被外源性核苷酸逆转（ER：HF为0.8±0.3，MSP12为0.8±0.1，图3g，h）。 由于用MPA抑制IMPDH可以抑制从头合成和补救合成GTP，目前尚不清楚是哪个途径介导了RT抵抗。因此，作者探究选择性抑制GTP补救合成是否会影响GBM对RT的抵抗。通过减少培养基中次黄嘌呤浓度（对照培养基30M，实验组0M）来阻断IMPDH依赖的GTP补救合成（图3a），并不能使U87MG细胞对RT敏感（补充图3F）。沉默编码HGPRT的基因HPRT1，保留次黄嘌呤（形成IMP）和鸟嘌呤（形成GMP）（图3a），对MSP12神经球的放射敏感性没有影响（补充图3G，H）。因此，从头合成的GTP，而不是补救合成的GTP，似乎在GBM的RT抵抗中起主导作用。 图3 补充图3 结果四：GTP的消耗减缓了RT诱导的DNA损伤的修复 作者推断，GTP耗竭可能通过减缓DSB修复使GBM对RT敏感，就像核苷酸补充促进DSB修复一样。与这一假说一致的是，在U87MG和A细胞中，与单独RT相比，联合使用MPA和RT可在不同时间点增加γ-H2AX水平（p0.01，图4a；p0.05，图4b，补充图4A，B）。这种增加被外源性核苷酸的补充所抵消（图4c，d，补充图4C，D）。同样，MPA增加了原代神经球中的γ-H2AX水平，核苷酸治疗逆转了这一情况（图4e，f；补充图4E，F）。因此，无论是对RT抵抗的GBM细胞系还是患者来源的GBM神经球，抑制从头嘌呤合成都会损害DSB修复，并以核苷酸依赖的方式使GBM放射增敏。 图4 补充图4 结果五：在GBM中支配RT抵抗的是嘌呤，而不是嘧啶 为了更准确地了解是哪些核苷酸介导了GBM中的RT抵抗和DSB修复，作者使用了特立氟米特，一种FDA批准的双氢旋酸脱氢酶（DHODH）抑制剂，用于嘧啶合成的限速酶（补充图5A）。特利氟米特降低了GBM细胞中的嘧啶浓度（补充图5B-F），但没有使耐RT的GBM细胞系放射增敏（图5a，b），或损害这些细胞系修复RT诱导的DSB的能力（γ-H2AX聚焦测量）（图5c，d；补充图5G，H）。 然后，作者探究嘧啶或嘌呤成分是否对核苷酸保护GBM免受RT损伤的能力负责（图2）。在对RT敏感的DBTRG-05MG细胞系中，嘌呤（腺苷和鸟苷）对RT诱导的DSB修复的促进作用几乎与总核苷酸一样（~90%）（图5e，补充图5I）。在对RT敏感的GB-1细胞系中也发现了类似的结果，与全部核苷酸相比，嘌呤促进了~64%的DSB修复（图5f，补充图5J）。嘧啶（胞苷、尿苷和胸腺嘧啶）单独不能促进DBTRG-05MG或GB-1细胞中RT诱导的DSB修复（图5e，f；补充图5I，J）。在HF神经球中，嘌呤核苷酸对DNA修复的刺激高达总核苷酸的（~%），而嘧啶单独的作用则较小（图5g，补充图5K）。因此，与嘧啶相比，嘌呤在介导GBM的DSB修复和RT抵抗中发挥了更大的作用。 图5 补充图5 结果六：抑制GTP合成可使GBM移植瘤模型辐射敏化 接下来，作者试图了解抑制GTP合成是否可以在体内的肿瘤模型中克服GBM的RT抵抗。作者使用了MMF，这是一种经FDA批准用于治疗器官排斥反应的口服可生物利用的MPA前药。因为在作者最初的分析中，U87细胞系是最耐RT的模型之一（图1a），作者在体内使用该模型。当异种移植瘤的大小为80-mm3时，它们被随机分为对照组、单独RT组、MMF组或MMF+RT组（补充图6A）。作者分析了第二次RT后2h的肿瘤亚群。RT后不久，大量鸟苷酸盐增加，当RT与MMF结合时，这种增加消失了（补充图6B）。γ-H2AX水平也在RT后升高，并在RT与MMF联合时进一步升高（补充图6C）。MMF自身诱导仅少量γ-H2AX产生。剩下的小鼠继续接受治疗以评估肿瘤的生长。单纯RT或MMF治疗可轻微减缓肿瘤生长，但联合RT和MMF治疗几乎完全抑制肿瘤生长（补充图6D）。当分析肿瘤增加三倍的时间时，这些变化也很显著（p0.05，MMF+RTvs.RT；p0.05，MMR+RTvs.MMF；p0.，MMF+RTvs.对照组；补充图6E）。 为了将这些发现扩展到更能代表患者GBM生物学的模型中，作者使用HF和MSP12神经球建立的肿瘤模型进行了类似的实验（图6a）。与永生化异种移植模型一致，HF异种移植在接受第二次RT剂量2h后，大量鸟苷酸升高。当MMF与RT同时给予时，这种增加再次消失（图6b）。在HF和MSP12肿瘤中，MMF增加了RT诱导的γ-H2AX（图6c）。在持续治疗评估肿瘤反应的动物中，单一药物MMF和RT均轻度减缓了HF和MSP12的肿瘤生长。然而，联合MMF和RT显著减缓肿瘤的生长（图6d，e），并增加肿瘤长至三倍的时间（图6f，g）。肿瘤长至三倍的平均时间（d）：HF细胞：12（对照组），16（MMF），23（RT），33（MMF+RT），MSP12细胞：10（对照），12（MMF），13.5（RT），19（MMF+RT）。治疗对正常组织的影响是比较小的，从药物治疗期间相对不变的体重可以看出（补充图6F，G）。与观察到的治疗效果一致，在所有三种模型中，与任一单独治疗相比，联合MMF和RT降低了细胞增殖标志物Ki-67的表达（补充图6H）。 图6 补充图6 结果七：MMF增强了GBM原位PDX模型的RT疗效 由于GBM微环境和较差的颅内暴露会限制药物疗效，作者试图了解MMF在颅内GBM模型中是否有效。作者将荧光素酶表达到GBM38中，这是一种本质上具有RT抗性的原代GBMPDX模型，该模型来自梅奥诊所的脑肿瘤患者来源的异种移植资源。颅内手术后，通过生物发光成像证实肿瘤启动，并随机接受对照组、RT、MMF或MMF+RT（图7a）。RT和MMF联合治疗可显著降低肿瘤的生物发光，但单独给予MMF或RT仅轻微影响肿瘤的生物发光（图7b，c）。与这些观察结果一致的是，与对照组（中位数42d）相比，MMF和RT联合治疗延长了小鼠生存时间（中位数62d），而MMF（中位数43d）或RT（中位数45.5d）单独治疗的效果最小（图7d）。因此，MMF抑制GTP合成可在颅内克服GBMRT抵抗。 结果八：IMPDH1高表达与GBM患者存活率低相关 最后，作者试图探究这些数据是否反映在GBM患者的预后中。作者从癌症基因组图谱中确定了例新诊断的原发性IDH野生型胶质瘤患者，他们中绝大多数接受了RT。IMPDH1转录表达增加与总生存率较低相关（p=0.）。IMPDH1是GTP合成的速率限制酶，也是MPA/MMF的靶标。IMPDH1高表达组和低表达组在已知的临床和病理生存因素方面相似，包括年龄（中位数60岁vs.59岁）和MGMT启动子甲基化（39vs.40%）。在新诊断的IDH野生型胶质瘤患者中，ATP从头合成合成（ADSS和ADSL）或嘧啶从头合成（DHODH和CAD）中限速酶表达的增加与存活率下降无关（图7e）。 作者对少数（n=22）IDH突变GBM的PANCAN数据集进行了探索性分析。IMPDH1和IMPDH2在这些患者中都不是预后不良的因素（补充图7A）。有趣的是，DHODH（嘧啶从头合成的限速酶）的高表达对IDH突变型GBM患者的预后不利，这表明对IDH突变型GBM，嘧啶生物合成的进一步研究可能是有趣的。总之，这些体外、体内和患者水平的数据表明，嘌呤，特别是GTP，介导了IDH野生型GBM的RT抵抗和DSB修复，抑制GTP的合成可能是一种有前景的GBM治疗策略，特别是结合RT。 图7 补充图7 结论： 1.嘌呤代谢产物，特别是鸟嘌呤，与辐射抵抗密切相关； 2.抑制GTP合成可通过损害DNA损伤修复能力使GBM细胞增敏，外源性嘌呤核苷酸通过促进DNA损伤修复保护敏感的GBM模型免受辐射；3.GTP从头合成的限速酶的高表达与GBM患者更短的生存期相关。 校对：杨格
