作者 郑业欣、项薇 来源 北拓资本医疗健康团队 01 基因治疗技术概况 基因治疗是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿缺陷和异常基因引起的疾病，以达到治疗目的的技术。 在生物体内，遗传信息沿着“DNA-RNA-蛋白质”的方向逐级传递（中心法则），蛋白质是遗传信息的表现形式，因此疾病发生时多表现为蛋白质层面的异常。目前绝大多数的药物均以蛋白质为靶点，如治疗肿瘤的小分子靶向药物和大分子单抗药物，通过改变蛋白质的功能来治疗疾病。基因治疗则是从蛋白质的上游——DNA入手，通过调控DNA来改变遗传信息传递，进而改变蛋白质的性状，实现从源头上治疗疾病。 1 基因治疗的分类 按照作用机制，基因治疗可分为3类： （1）将致病基因替换为健康基因拷贝； （2）将功能不正常的致病基因失活； （3）引入新的或者修饰的基因到机体来帮助治疗疾病。 按照技术方式，基因治疗可分为5类： （1）质粒DNA：基因工程化的、能够将治疗性基因导入人类细胞的环形DNA分子； （2）病毒载体：病毒有将基因材料导入细胞的天然能力，因此一些基因治疗产品由病毒而来。一旦病毒经过改造去除其引发传染性疾病的能力，这些改造后的病毒就可以被用作载体来将治疗性基因导入人体细胞； （3）细菌载体：细菌也可以通过改造去除其引发传染性疾病的能力而被作用载体来将治疗基因导入人体组织； （4）人体基因编辑技术：基因编辑的目标是破坏有害基因或者修复变异基因； （5）细胞基因治疗产品：从患者提取细胞后，经过基因改造（通常使用病毒载体）后返输回患者体内。 按照治疗方式，基因治疗可分为2类： （1）体内基因治疗：直接向血液或者目标器官中注射携带所需基因的载体； （2）体外基因治疗：把患者的细胞从体内移出，通过在体外对于细胞进行基因改造，重新输入至患者的体内。 2 转基因技术：递送系统 基因治疗最初主要就是用于正常基因功能缺失遗传病的治疗，如联合免疫缺陷（患者20号染色体上的遗传突变）。因此对于该类疾病的治疗，最直接的思路就是利用载体将正常基因导入患者体内实现治疗。目前最常用的载体就是人工改造后的工程病毒，病毒载体是指以病毒为基础的基因载体，对病毒基因组进行操作和改造，使它携带外源基因和相关基因元件，并被包装成病毒颗粒。目前临床上基因治疗使用最多的病毒载体就是逆转录病毒、慢病毒和腺相关病毒。 图：基因治疗示意图 病毒载体 1.逆转录病毒Retrovirus 逆转录病毒是由两条单链RNA、逆转录酶、核衣壳和包膜组成。其主要优势表现在感染效率高、感染细胞谱系广和基因稳定表达等。然而逆转录病毒载体其病毒本身的特性也带来了诸如病毒毒性、免疫原性、基因插入突变等诸多问题。 2.慢病毒Lentivirus 慢病毒载体是以HIV（人类免疫缺陷病病毒）为基础发展起来的基因治疗载体，能有效的感染包括神经元细胞在内的多种类型细胞，对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。慢病毒基因组为正链RNA，进入细胞后反转录成DNA，整合进细胞基因组中，从而实现目的基因在细胞内长期、稳定的表达。慢病毒载体具有宿主范围广，免疫原性低，基因容量大，可以长期表达等特点，目前被应用于治疗一些遗传性疾病。 3.腺相关病毒AAV 腺相关病毒是一类单链线性DNA病毒，不能独立复制，只有在辅助病毒存在下才能感染并裂解宿主细胞。腺相关病毒的主要优势是基因组非整合性，其进入宿主细胞后是以游离DNA的形式存在，不会插入宿主基因组，也就不会引起宿主细胞基因组的插入突变，从而提高了基因治疗的安全性。同时，腺相关病毒具有组织靶向性，不同亚型的病毒对不同的组织具有不同的亲和力。但是腺相关病毒也存在一些弊端，如可携带的基因片段小，目的基因易被稀释等。目前，腺相关病毒AAV已经成为恶性肿瘤基因治疗研究中一个重要角色。 资料来源：CurrentOpinioninPharmacology，amsbio 非病毒载体 近年来科学家们开始利用非病毒载体将目的基因运送到患者细胞内（包括裸露的质粒、裸露DNA-反义寡核苷酸、微环DNA等），物理方法有显微注射、基因枪和电转导等，化学方法有脂质体和纳米颗粒等。非病毒载体具有高DNA稳定性、低细胞毒性、弱免疫原性的优势，并且生产流程更加标准化，大规模生产更为容易。目前非病毒载体技术还在不断优化，待技术更加成熟以后，未来也会迎来更大的应用范围。 3 基因编辑技术 基因治疗的核心策略是基因编辑技术，指对基因组中目的基因的一段核苷酸序列甚至是单个核苷酸进行替换、删除、增加或插入外源的DNA序列，从而在基因水平影响机体生命活动过程。 基因编辑技术包括类转录激活因子效应物核酸酶技术（TALENs）、锌指核酸酶技术（ZFNs）和CRISPR-Cas9技术。由于CRISPR-Cas9系统的便捷性、高效性和可控和定向操作的特点，也是目前最简单、最通用和最精确的基因编辑技术。 CRISPR-Cas9复合物来源于细菌和古细菌适应性免疫系统，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。化脓性葡萄球菌的CRISPR-Cas9系统可以在哺乳动物细胞中产生靶向双链DNA断裂，这一发现开启了基因工程的一场新革命。 CRISPR/Cas9通过对预设的DNA位点进行切割，造成DNA双链断裂（DSB,doublestrandbreak）。这种DNA的损伤可以启动细胞内的修复机制，主要包括两种途径：一是低保真性的非同源末端连接途径（NHEJ，Non-homologousendjoining），此修复机制非常容易发生错误，导致修复后发生碱基的缺失或插入（Indel），从而造成移码突变，最终达到基因敲除的目的。NHEJ是细胞内主要的DNA断裂损伤修复机制。二是DNA断裂修复途径为同源介导的修复（HR,homology-directedrepair），这种基于同源重组的修复机制保真性高，可以实现基因组的精确编辑，如：条件性基因敲除、基因敲进、基因替换、点突变等。 图：CRISPR/Cas9作用机制资料来源：Vox 4 广义的基因治疗包括CAR-T和溶瘤病毒 CAR-T CAR-T(嵌合抗原受体T细胞)是通过基因改造技术，让患者T细胞表达嵌合抗原受体，使效应T细胞的靶向性、杀伤性和持久性均较常规应用的免疫细胞高，并能克服肿瘤局部免疫抑制微环境和打破宿主免疫耐受状态。通俗的说，CAR-T就如同携带“导航仪”，帮助T淋巴细胞识别肿瘤细胞进行定向清除。 CAR-T细胞疗法技术优势：治疗更精准，多靶向更精准，杀瘤范围更广，杀瘤效果更持久。 图：CAR-T治疗示意图资料来源：MedicalXpress 溶瘤病毒 溶瘤病毒被定义为基因工程或天然存在的病毒，其可以选择性地复制和杀死癌细胞而不伤害健康组织。与基因治疗不同，病毒在基因诊疗中仅用作转基因传递的载体，而溶瘤病毒治疗使用病毒本身作为活性药物转运蛋白。 溶瘤病毒的作用机制： （1）直接裂解肿瘤细胞； （2）病毒感染的肿瘤细胞表达相关信号并释放大量细胞因子造成免疫细胞对肿瘤细胞浸润； （3）裂解的肿瘤细胞释放特异性抗原和免疫相关因子，诱发机体产生抗肿瘤免疫反应； （4）溶瘤病毒可以作为载体携带肿瘤抑制基因、促凋亡基因、抗血管生成基因、自杀基因和免疫调节基因，调控肿瘤免疫耐受微环境。 图：溶瘤病毒作用机制资料来源：药学速览 5 基因治疗的基本程序 目的基因的选择和获取 目的基因与转运载体结合 靶细胞的确认 载体携带外援基因进入细胞 外源基因的整合 外源基因的表达及检测 治疗作用及稳定性、安全性评价 02 基因治疗的发展历史和最新研究进展 1 基因治疗：螺旋式前进 年，首次提出基因交换和基因优化的理念，为基因治疗的发展奠定了基础； 年，发明逆转录病毒载体系统，高效地将外源基因导入哺乳动物细胞； 年，历史上首例基因疗法ADA-SCID临床成功，表明基因治疗可以安全有效地用于人体； 年，ZFN基因编辑技术发明； 年，基于腺病毒载体的基因治疗失败，发展进入“黑暗时期”。 年，CDFA首次批准p53抗癌注射液（年因生产流程问题被注销）； 年，TALEN基因编辑技术发明； 年，CRISPR/Cas9基因编辑技术发明；世界上第一个针对遗传性疾病的基因治疗产品Glybera获EMA批准（AAV病毒载体）； 年，Amgen公司的溶瘤病毒药物上市； 年，GSK公司针对儿童重症联合免疫缺陷病的基因疗法Strimvelis上市； 年，诺华公司针对B细胞急性淋巴细胞白血病的CAR-T疗法上市；Spark公司针对遗传性眼疾的体内基因疗法Luxtuma上市。 2 基因治疗的最新研究进展 CRISPR-Cas9基因编辑系统被视为本世纪最为重要的生物发现之一，法国生物化学家EmmanuelleCharpentier（埃马纽埃尔·卡彭蒂耶）、美国生物学家JenniferDoudna（詹妮弗·杜德娜）因作为该技术的发现者获得了年诺贝尔化学奖。 CRISPR-Cas9技术适应症选择：以单基因遗传病为主，按照发展速度由快到慢依次是眼科、血液疾病、神经系统疾病，目前研究人员们正在探索艾滋病、阿尔茨海默病、精神分裂症等疾病的治疗方法。 年9月，中国科学家利用CRISPR-Cas9完成了世界首例基于基因编辑干细胞治疗艾滋病和白血病的案例，该研究发表在国际顶级医学期刊《(TheNewEnglandJournalofMedicine》上。该研究建立了基于CRISPR在人成体造血干细胞上进行CCR5基因编辑的技术体系，实现了经基因编辑后的成体造血干细胞在人体内长期稳定的造血系统重建。 年6月6日，巴塞尔分子与临床眼科研究所（IOB）与德国灵长类动物中心（DPZ）的科学家们合作开发了一种全新的基因疗法治疗黄斑变性引起的视力受损，该研究发表在《Science》杂志上。该研究设计了一种三组分系统（第一个成分包含工程DNA，可确保编码热敏通道的基因仅在感光细胞中表达。第二个成分是金纳米棒，可以有效吸收近红外光。第三种成分是确保在感光器中表达的热敏通道与局部捕获近红外光并局部释放热量的金纳米棒之间牢固结合的抗体），使用近红外光激活退化的感光器从而挽救视力。 年12月5日，《TheNewEnglandJournalofMedicine》同期发表了两项关于β-地中海贫血症和镰刀状细胞贫血症的基因治疗临床试验。为了治疗三名镰状细胞患者，研究人员采集了未成熟的血液干细胞，利用CRISPR技术和RNAi技术降低细胞中的BCL11A的表达，进而重新激活γ-珠蛋白的表达，最终提高胎儿血红蛋白（HbF）的水平，使得患者摆脱输血依赖，达到治疗的目的。 3 基因治疗核心难点 与常规的药物/治疗方案相比，基因治疗能从源头上解决疾病的发生，故而在一些目前无法治疗或疗效不佳的疾病上有明显优势，比如血友病等。在安全性上，基因治疗仍属于新兴技术，基因更改后通常难以逆转，潜在风险较大，更多作为常规治疗方案的补充。如何预测和利用个体性将是未来基因治疗向临床转化的关键。 ▌递送系统的核心难点 非病毒载体主要通过物理和化学方法来转染治疗性遗传物质，但非病毒载体体内转染效果不高，主要原因是运送DNA过程中会有多道生理屏障的干扰（包括细胞膜、内涵体-溶酶体系统、核膜等）。 ▌基因编辑系统的核心难点 ▌CAR-T技术的核心难点 ▌溶瘤病毒的核心难点 ▌商业角度 如何定价以及制定支付政策是挑战。定价高成为基因治疗产品的一个推广障碍，首个上市的基因治疗产品定价万欧元，上市4年仅有1例治疗。从目前的发展看，“基于临床疗效”的分阶段支付模式可能会是一个趋势。在这种模式下，对长期疗效的评估、与政府或保险公司的合作谈判至关重要。 4 基因治疗产业介绍 上游：动物模型定制 随着药物研发的不断深入，免疫疗法和基因疗法发展迅速，相关领域竞争逐渐白热化。在此背景下，一个能够高效稳定地实现多种人源免疫细胞重建的动物模型平台以及合适的动物疾病模型成为相关企业在进行临床前研究的必要选择。 人类疾病动物模型是指医学研究中建立的具有人类疾病模拟表现的动物实验对象和相关材料。动物模型具有两个功能组件：一是可操控性，用于模拟疾病的特点；二是可检测性，用于衡量对模型的操控所产生的改变。利用动物模型，可以进行基因功能研究、人类疾病研究、药物筛选、基因示踪等。 目前，全球实验动物已从小鼠和大鼠扩展到线虫、果蝇、蟾蜍、斑马鱼、豚鼠、兔、犬、猪、猴等不同进化地位的物种。在大、小鼠等常用物种中，又培育出余种不同生理特点的品系。随着基因修饰技术的出现和不断发展，转基因、基因敲除大小鼠品系已经超过个，基因修饰兔、猪、犬、猴等也相继出现，成为开展生命现象研究、疾病机制研究、药物评价等不可或缺的研究资源。 目前，中国实验动物年使用量接近万只，是国际第二大实验动物生产和使用的国家。目前，中国在基因编辑动物研究方面已经国际领先，率先报道了基因编辑大鼠、犬、猪、猴等模型的研发。 重点：实验动物与人类在基因组、基因调控、细胞类型、器官结构与组成、疾病类型等方面是存在差别，如何提升动物模型与人类疾病的相似性是实验动物科学核心追求之一。近年实验动物研究的一个热点是实验动物人源化。 基于基因编辑技术和干细胞培养技术，实验动物人源化有两种方式：一种方式是基因人源化，将人类的抗体、病原受体、药物代谢基因等敲入到实验动物基因组而代替动物原有的基因，使动物可以分泌人类抗体、可以感染人传染病病原、可以与人类有相似的药物代谢行为和毒理表型。二是细胞人源化，在免疫缺陷的动物中注射一定量的人类细胞或干细胞，使动物的组织有一定量的人类细胞，形成细胞人源化动物模型。尽管实验动物人源化仍处于研发阶段，但是已经展示了广泛的应用前景，会有更多的人源化模型涌现。 上游：病毒载体和质粒DNA的定制 病毒载体和质粒DNA可用于治疗多种疾病，市场的需求旺盛。基因疗法的高成本预计会阻碍病毒载体和质粒DNA制造市场的增长，但预计个性化医药行业的兴起将为此提供巨大的增长机会。 病毒载体是实现基因递送、完成基因操作的关键环节，对病毒载体的改造在研究和应用中有着特殊的重要地位。如现在研究中常用的重组腺相关病毒（Re
